第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。I

第三步：将目的基因导入受体细胞_
1. 转化的概念：
是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。I

第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。I

“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：
能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：
经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。I

“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：
E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同：
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。I

“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是¬¬质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。I

细胞于孵箱中培养1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。
（3）丁酸钠处理细胞
丁酸钠的作用机制并不确定；但它是组蛋白乙酰化形成使外来质粒DNA趋于转录的染色质结构（Workman and Kingston 1998）。
1）甘油休克处理后，将500 mmol/L丁酸钠直接加入生长培养基（甘油处理的步骤d）。细胞类型不同，所用丁酸钠的浓度也不同。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他细胞系所需浓度依经验而定。
2）细胞于孵箱中培养1~6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。
6）若要检测细胞转染后导入DNA的瞬时表达，可在转染后1~6天收获细胞。杂交分析DNA或RNA。通过体内代谢标记进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
7）分离稳定转染体
(1)用非选择性培养基孵育细胞24~48 h，使转染的DNA有足够时间表达。
(2)胰酶消化细胞并重铺细胞于选择性培养基中，或者直接加选择性培养基/
(3)每2~4天更换培养基，持续培养2~3周，目的是清除死细胞残骸，促进抗性细胞生长。
(4)克隆独立菌路、繁殖，以用于检测（方法见Jakoby and Pastan 1979或Spector et al. 1998b [《细胞试验手册》的第86章]）。
(6)用预冷的甲醇固定细胞15 min，然后室温下用10% Giemsa染色15 min，流水冲洗，这样可以记录细胞克隆数目。I

2．物理方法
（1）电穿孔转染DNA
1）细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4℃、500g离心5 min（Sorvall H1000B转子用1 500r/min）.
2）用0.5体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目。
3）离心（同步骤1）收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至2.5×106~2.5×107细胞/ml。
4）将400μl的各等份细胞悬液（106～107细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5）设置电转化参数。一般电容量为1050μF。电压在200 V和250 V之间，不同细胞系所需电压不同，平均为260 V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有PBS的电转化池放电至少两次。
6）每一装有细胞的电转化池内加入10～30μg、体积最大可至40μl的质粒DNA。用吸管将DNA与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第7步。
7）立即将电转化池移至电极间放电，1～２min后，取出电转化池，水浴，立即进行下一步操作。
8）用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至35 mm培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加入培养皿。培养皿置于含5%～7% CO2的37℃孵箱。
9）重复第6～8步，电转化所有DNA与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10）如要获得稳定转化体，直接进行第11步。如果是瞬时表达，则于电穿孔24～96 h后用下述方法之一检测细胞：
*如果使用的是表达E.coli β-半乳糖苷酶的质粒DNA，检测细胞裂解液中酶活性。
*如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在450~490 nm光照下用显微镜检测细胞。
*如果使用其它基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
11）分离稳定转染体：用完全培养基培养48~72 h后，胰酶消化细胞，用适当的选择性培养基重铺细胞。每2~4天换液一次，持续2~3周，目的是去除死细胞残骸，并允许抗性细胞克隆生长。此后，克隆、繁殖独立克隆以用于检测I

将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。

一、工具酶：
基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA 的切割，来限制外源性DNA 侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。
根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III

第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量。
第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。
其中II 类酶在基因重组中最有应用价值。因此以下内容均以II 类限制性内切酶为主。I

1．限制性内切酶的命名和书写
限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。现在通用的命名原则是：第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。比如限制酶HincⅡ和HindⅢ 则是分别来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c 和d 血清型菌株。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表，I

2．限制性内切酶的特点：
①识别特定的核苷酸序列：长度一般为4~6bp 并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA 顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。
例如：
②具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA 进行切割，由此产生特定的酶切末端。通常双链DNA 被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。
③由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA 序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。I

例如，限制酶BamH I 和 BglⅡ都能识别各自的6 核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC 和AGATCT， 因此产生的DNA 片段都产生一个相同的单键5’端突出 (突出序列是GATC)。当这些酶作用DNA 分子后，它们都能相互连接，但是新形成的DNA 分子将同时失去这两种酶的识别序列。如：
通常，不同的限制酶具有不同的识别序列，但有些不同来源的酶能识别相同的序列，这些酶被称为同裂酶（isoschizomer），不过其中有些酶具有相同的切点，而有些酶的切点却并不相同，如Acc Ⅲ与BspEⅠ、BseAⅠ、BsiMⅠ、Bsp 131、Kpn21、MroⅠ识别序列都是TCCGGA,t 它们的切点都在T 和C 之间，即T/CCGGA；但BbeⅠ与KasⅠ、NarⅠ、SfoⅠ识别序列都是GGCGCC，但它们的切点分别为GGCGC/C、G/GCGCC、GG/CGCC、GGC/GCC。
现在已从各种微生物中发现三千余种限制酶，它们识别序列的长度最短的是4 个核苷酸，最长的为8 个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高的是识别6 个核苷酸的限制酶。这是因为由4个核苷酸组成的识别序列在DNA分子中出现的频率很高，如果按完全随机分布的原则，每44＝256个核苷酸可出现一个相同的4 核苷酸识别序列。如果是由6 个核苷酸序列组成的限制酶识别位点，那么就应该有46＝4096 bp才可能出现一次。识别8 个核苷酸的限制酶识别位点就应该有48＝65,536 bp才重复一次。因此，在一个DNA分子中，识别4 个核苷酸的限制酶位点太多，识别8 核苷酸的限制酶位点又太少。换句话说，识别4 核苷酸的限制酶将DNA切得太短，识别8 个核苷酸的限制酶将DNA切得太长，而识别6 个核苷酸的限制酶则比较适中，切下的DNA片段平均长4.1 kb左右。除此之外，片段过长或过短，从技术角度讲，操作起来也不太方便。
实际上，任何一种生物基因组的DNA 分子中的核苷酸分布并不是完全随机的。也就是不同物种的基因组DNA 中，所含的限制性内切酶位点的种类和数量各不相同。也正由于此，可以通过绘制限制性内切酶图谱来描述某一个I